市場上近幾年涌現(xiàn)出不少自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器。這種儀器利用光學(xué)顯微鏡技術(shù)，但帶來了更高的準(zhǔn)確性、重復(fù)性，并將這一單調(diào)的工作自動化。樣品體積小也是這種細(xì)胞計(jì)數(shù)器的額外優(yōu)勢。許多儀器使用一次性的玻片，只需要10-20 uL樣品。將玻片插入自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，照相機(jī)捕獲圖像。隨后內(nèi)置的軟件分析圖像，顯示細(xì)胞數(shù)量等信息。
在此，專家介紹了使用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器的三個(gè)tip。
準(zhǔn)確對焦
與其他光學(xué)顯微鏡一樣，儀器的準(zhǔn)確對焦對于計(jì)數(shù)很關(guān)鍵。在手動計(jì)數(shù)時(shí)，訓(xùn)練有素的大腦可輕松鑒定細(xì)胞。然而，自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)的照相機(jī)檢測活細(xì)胞的亮中心和暗邊緣，將其處理成黑白像素信息。如果細(xì)胞未準(zhǔn)確對焦，那么亮中心將有明顯的灰度，會被誤認(rèn)為是死細(xì)胞。
大部分研究人員將會發(fā)現(xiàn)對焦并不難，只要顯示在屏幕上的圖像質(zhì)量與傳統(tǒng)的顯微鏡相似。確保你有一張清晰的圖像，這很重要。另一點(diǎn)是要了解細(xì)胞計(jì)數(shù)器中照相機(jī)的分辨率。如果自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器以低的幀速顯示，如每秒小于15幀，那么顯示的圖像將不能實(shí)時(shí)響應(yīng)聚焦旋鈕的微調(diào)。
控制玻片之間的差異
大部分基于圖像的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器都使用一次性的玻片，其上有明確的測量區(qū)域。這一測量區(qū)域被物鏡的放大率和照相機(jī)的圖像傳感器大小所設(shè)定。這些細(xì)胞計(jì)數(shù)器通常測定0.4-0.5 uL樣品，相當(dāng)于血球計(jì)數(shù)器的4-5個(gè)大方格。
與血球計(jì)數(shù)器不同，計(jì)數(shù)玻片通常只使用一次。因此，玻片之間的差異會顯著影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果。對于某一組實(shí)驗(yàn)，好使用同一批號的玻片，盡量避免這些差異。在更換批號時(shí)，也建議用標(biāo)準(zhǔn)的微珠來檢驗(yàn)玻片。大部分細(xì)胞計(jì)數(shù)器制造商都提供已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)微珠。使用相同的微珠樣品來檢驗(yàn)不同的玻片，將有助于發(fā)現(xiàn)差異。
評估軟件的分簇性能
自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器的核心是開展分析的軟件，它相當(dāng)于手動計(jì)數(shù)時(shí)的人腦。大部分的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器包含集成軟件，能準(zhǔn)確地計(jì)算單細(xì)胞群體的數(shù)量。然而，在談到成簇細(xì)胞的計(jì)數(shù)時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)器就會存在明顯差異。由于從培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的樣品并不總是單細(xì)胞群體，因此，有時(shí)會有多個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊，而自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器的分簇（declustering）性能也仔細(xì)評估。評估分簇性能時(shí)可開展圖1的檢測。
圖1. 將HL-60細(xì)胞加熱到70°C，處理20分鐘，殺死細(xì)胞，獲得死細(xì)胞樣品。隨后利用兩款不同的自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行樣品的檢測。在細(xì)胞計(jì)數(shù)之后，根據(jù)軟件捕獲的圖像進(jìn)行比較。紅色圓圈：死細(xì)胞；藍(lán)色圓圈：活細(xì)胞；黑色圓圈：排除的對象。
自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器正在取代單調(diào)乏味的手動計(jì)數(shù)方法。隨著對一些基本原理的了解，自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器將幫助你獲得佳的結(jié)果。