2023年5月22日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所汪迎春團隊在Molecular & Cellular Proteomics雜志上發表了題為“Parallel Proteomic Comparison of Mutants With Altered Carbon Metabolism Reveals Hik8 Regulation of PII Phosphorylation and Glycogen Accumulation in a Cyanobacterium”研究論文。該研究采用TMT定量蛋白質組學與PRM靶向蛋白質組學相結合的方法，并結合磷酸化占比率分析和后續實驗驗證，系統解析藍細菌碳代謝蛋白質調控網絡并揭示組氨酸激酶Hik8參與碳氮平衡的調控。
碳代謝是光合生物的核心代謝，涉及眾多蛋白質的協同運作和調控。在藍藻中，參與碳代謝的蛋白質其表達受到多種因子的調控，包括RNA聚合酶σ因子SigE、組氨酸激酶Hik8、Hik31和其質粒上的同源蛋白Slr6041，以及二元信號系統的響應應答因子Rre37。然而，目前還不完全清楚這些調控因子是如何特異或協同調控參與碳代謝的蛋白或蛋白質網絡。
為了解決這一問題，研究團隊使用了Thermo Scientific™ Orbitrap質譜儀結合TMT標記定量蛋白質組學技術，對野生型和碳代謝調控因子的缺失突變體進行了橫向的差異蛋白質組學分析。TMT定量蛋白質組數據利用EASY-nLC 1000納升液相和LTQ Orbitrap Elite質譜采集。蛋白質組分析的整體策略如圖1A所示，通過在重復實驗之間重新排列TMT標記的順序，避免了由于每種TMT試劑導致的定量偏差(圖1B)。總共鑒定出2543種蛋白質(覆蓋70%的藍藻蛋白)，其中2189種蛋白質在至少兩個重復實驗中包含定量的TMT信息，用于進一步的統計和生物信息學分析(圖1C)。
圖1.藍藻野生型與碳代謝調控蛋白突變株在光自養條件下的蛋白質組定量鑒定(點擊查看大圖)
所有樣本的重復實驗均正確聚類，表明定量具有高可重復性(圖2A)。研究團隊通過學生t檢驗(p < 0.05)和1.3倍的倍數變化閾值，分別在Δhik31、Δhik8、Δrre37、ΔsigE和Δslr6041中鑒定出40、116、49、78和129種差異表達蛋白(圖2B)。部分差異表達蛋白通過免疫印跡法進一步驗證，這些蛋白大多與碳代謝相關(圖2C)。
圖2.碳代謝調控因子突變體中差異表達蛋白的篩選
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為了更好地可視化至少被兩個碳代謝調控蛋白調控的蛋白質，研究團隊利用五個碳代謝調控蛋白作為中心節點，構建了一個包含80種在至少兩個突變株中發生顯著變化的蛋白質的調控網絡(圖3)。該網絡清晰地展示了調控的交叉作用，這可能對藍藻的生長以及應對代謝和環境變化至關重要。
圖3. 碳代謝調控因子共同調控的差異表達蛋白
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糖原是藍細菌的關鍵碳源和能量儲存物質。在黑暗條件下，糖原分解和細胞呼吸對細胞存活至關重要。研究發現，Δhik8突變株中糖原含量顯著降低，而其他突變株未受影響(圖4A)。盡管Δhik8中糖原合成相關蛋白未顯著下調，這暗示可能存在一種新的Hik8依賴的糖原積累機制。糖原積累受細胞內碳氮比(C/N平衡)調控，而該平衡通過蛋白PII的磷酸化狀態感知和調節。
研究團隊發現，組氨酸激酶Hik8特異調控藍細菌碳氮的主要感受信號PII蛋白第49位絲氨酸(S49)的磷酸化(圖4B和C)。為驗證PII S49位點磷酸化的上調以及其在Δhik8突變株中的調控作用，研究團隊采用了PRM靶向蛋白質組學方法，定量分析了野生型和Δhik8突變株在不同營養條件下磷酸肽段的豐度。PRM靶向蛋白質組學利用EASY-nLC 1000納升液相和Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質譜儀進行定量分析。結果顯示，在自養(AT)條件下，Δhik8中PII S49磷酸化水平顯著上調，且遠超TMT定量結果(圖4D)。考慮到磷酸化會改變肽段的電荷狀態，從而影響磷酸化肽段和非磷酸化肽段在質譜分析中的電離效率和檢測靈敏度，研究團隊進一步計算了PII S49磷酸化占比率。結果表明，Δhik8中近70%的PII蛋白發生磷酸化，而野生型中不足4%(圖4E)。
圖4.Δhik8突變體中糖原含量的降低及PII磷酸化水平的上調
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進一步研究發現Hik8的缺失導致PII S49磷酸化水平顯著上調，并伴隨突變體糖原含量和黑暗生存能力顯著下降，而將PII S49突變為丙氨酸以模擬其去磷酸化狀態則能恢復Hik8缺失突變體的糖原含量和黑暗條件下的生存能力(圖5)。
圖5.PII S49A突變恢復了Δhik8的糖原含量并挽救其在黑暗條件下的生存能力(點擊查看大圖)
總 結
綜上所述，該研究不僅系統地解析了碳代謝調控因子和相應靶蛋白之間調控的特異和協同性，同時還首次揭示了二元信號系統調控PII的磷酸化，并進而調控碳氮平衡。由于Hik8是藍藻生物鐘的重要信號輸出組分，該研究說明藍細菌的碳氮平衡也可能受到生物節律性調控。
簡 介
中國科學院遺傳與發育生物學研究所的汪迎春研究員為本文通訊作者。該研究所的黃成成博士和段曉曉博士為該研究論文的共同第一作者。該研究得到國家科技部、中科院戰略先導計劃和國家自然科學基金項目的資助。
中國科學院遺傳與發育生物學研究所公共技術中心蛋白質組學平臺依托高端質譜設備配置和專業技術人才隊伍為所內外研究工作提供高水平的科研及技術服務。平臺具有先進高端的質譜儀器：Orbitrap Exploris™ 480、Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™以及Thermo Scientific™ Orbitrap Elite質譜儀等。
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寫在最后，但同樣重要哦~：
我們深知用戶對于蛋白質組學從樣品前處理，到上機以及數據分析的全流程培訓班的需求頗多，故賽默飛將聯手中國科學院遺傳與發育生物學研究所汪迎春研究員課題組(暨本次分享文獻的通訊作者)，在2025年8月下旬開展第一期約5個工作日的基于涵蓋蛋白質組學基本原理、樣品制備、數據分析及軟件操作(MaxQuant、Perseus、Proteome Discoverer等)的系統性的蛋白質組學培訓班，培訓班將以小班教學、實操為主。
本通知為第一次通知，培訓班具體時間初步定于2025年8月25日至8月29日，培訓地址為北京市中國科學院遺傳與發育生物學研究所內，其余相關具體事務，我們將再后續發布專項通知，敬請關注！
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