摘要：目的利用電噴霧離子化為接口（ESI）的液相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC—MS），鑒定重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（rLTB）氨基酸序列結(jié)構(gòu)的正確性。方法利用SDS—PAGE分離、呈現(xiàn)蛋白混合物，胰蛋白酶原位水解rLTB．HPLC—MS聯(lián)機(jī)制備肽指紋圖，分析肽指紋圖獲得rLTB氨基酸全序列信息。結(jié)果 rLTB的全序列結(jié)構(gòu)與理論的全序列結(jié)構(gòu)*一致。結(jié)論改進(jìn)的HPLC—MS測(cè)定條件穩(wěn)定，提高了質(zhì)譜靈敏度，結(jié)合肽指紋圖的分析結(jié)果，可以驗(yàn)證蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
關(guān)鍵詞：rLTB；原位酶解；HPLC—MS；肽；指紋圖譜
The Structure Identification of rLTB by HPLC-MS
YANG Jun，TIANG Wen—Biao，ZHU Yong—Hong，ZOU Quan—Ming
（Department of Clinical Microbiology，3bird Military Medical University，Chongqing 400038 China）

ABSTRACT：Aim 3he correcTESS of the primary structure of recombinant heat—labile enterotoxin B was identified by liquid chromatography／electrospray ionization mass spectrometry．Methods rLTB in SDS— PAGE gel was digested by trypsin，an d its peptide finger mapping Was m pared by improved HPLC—MS methods．By an alyzing peptide finger mapping，the primary structure of rLTB Was identified ．Results： 3heoretic an d actual primary structure of rLTB is consistent．Conclusion Improved HPLC — MS conditions were stable．3he sensitivify of MS Was increased ．Whole amino acid sequence of proteins were detected ．
KEYWORDS：rLTB；Tryptic digestion in gel；HPLC—MS；Peptide finger ma pping

    大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat—labile enterotoxin，LT）是產(chǎn)毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic E．coli，ETEC）分泌的一種熱不穩(wěn)定性腸毒素，由A、B二個(gè)亞單位組成，其中A亞單位通過(guò)其GTP依賴的ADP一核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性引發(fā)毒素效應(yīng)，B亞單位可以與真核細(xì)胞表面的GM1一神經(jīng)節(jié)苷脂受體特異結(jié)合，幫助A亞單位進(jìn)人細(xì)胞，結(jié)合到靶細(xì)胞上。由于LT的B亞單位（LTB）的毒性低，粘膜免疫佐劑活性高，在口服蛋白疫苗研究中，作為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)的佐劑，引起廣泛的興趣。
    8O年代末二種軟電離技術(shù)的發(fā)明，使質(zhì)譜邁人了生物大分子的研究領(lǐng)域，并極大地推動(dòng)了蛋白組研究進(jìn)程。其中一種軟電離技術(shù)是電噴霧離子化（eleetrospmy ionization，ESI），ESI能產(chǎn)生多電荷峰擴(kuò)大了分子量的測(cè)定范圍，同時(shí)提高了靈敏度和準(zhǔn)確性。HPLC能分離得到較多的蛋白滿足后續(xù)的鑒定，與質(zhì)譜（MS）直接連接使用自動(dòng)化程度高、重復(fù)性好?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，隨著HPLC—MS的發(fā)展和改進(jìn)，成為了蛋白組學(xué)研究的核心技術(shù)。利用DNA重組技術(shù)將LTB基因通過(guò)合適的載體克隆到易于操作和培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，再分離純化表達(dá)產(chǎn)物，即rLTB。驗(yàn)證rLTB氨基酸全序列的正確性是基因工程產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。肽圖譜（peptide mapping）是蛋白質(zhì)經(jīng)水解后測(cè)定肽段以獲得相關(guān)的信息，是生物制品高特異的鑒定方法。目前主要有液相肽圖和質(zhì)譜肽圖，前者根據(jù)肽段在色譜柱上的分離行為差異而獲得，主要檢測(cè)蛋白質(zhì)制品的穩(wěn)定性，后者經(jīng)色譜柱分離后通過(guò)質(zhì)譜分析每個(gè)肽段的準(zhǔn)確分子量，從而鑒定蛋白質(zhì)的初級(jí)結(jié)構(gòu)。色譜分離蛋白質(zhì)和肽zui常用zui有效的流動(dòng)相體系是乙腈、水和三氟乙酸，但對(duì)于電噴霧質(zhì)譜（ESI—MS），三氟乙酸根是具有強(qiáng)離子對(duì)效應(yīng)的陰離子，與質(zhì)子化肽段生成電中性的離子對(duì)，抑制多肽ESI—MS的質(zhì)譜信號(hào)。本文采用了改進(jìn)色譜條件，直接HPLC—MS聯(lián)機(jī)檢測(cè)，獲得rLTB的HPLC肽圖和Ⅲ，LC／MS肽圖并驗(yàn)證了rLTB的氨基酸全序
列結(jié)構(gòu)。
1 材料與方法

1．1 試劑與儀器：色譜純乙腈、三氟乙酸（TFA）、乙酸（均為美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品）；超純水的電阻率為18．2MI2；胰蛋白酶[（經(jīng)11PICK處理）為Promega公司]；rLTB（由本教研室純化組提供，批號(hào)011205）。其余試劑均為分析純。流動(dòng)相A：1000ml超純水。流動(dòng)相B：乙腈800ml和水200ml。胰蛋白酶溶液：用緩沖液將胰蛋白酶配制成1mg/ml 的溶液。1100HPLC／1946B型液質(zhì)聯(lián)用儀：在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光二極管陣列紫外可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器、ESI接口的四極質(zhì)譜檢測(cè)器（均為Agilent公司）。色譜柱Zorbax 300SB．C18（5tan，2．1mm×150mm）；保護(hù)柱Zorbax 300SB．C18（5μ，2．1mm×12．5mm，均為Agilent公司）。

1．2 方法

1．2．1 SDS—PAGE電泳條件：采用15％分離膠，5％濃縮膠，rLTB上樣量10μg，聚集電壓80V，lh，分離電壓65V，3h。考馬斯亮藍(lán)染色。

1．2．2 胰蛋白酶水解方法：用刀片從電泳膠上切下目的蛋白帶，將其切成1mm2大小的膠塊。放人含有50％ 乙腈，50mmol/L 的NH4HC03溶液中，搖床上25Or／rnin，20min震蕩清洗，重復(fù)三次。將膠片置鼓風(fēng)干燥機(jī)中70℃干燥，30min。加人2O 酶溶液和2O 的50mmol/L 的NH4HC03溶液，蓋上塞，輕搖，37℃水浴18h。取出加人乙酸2Oμl 終止反應(yīng)。

1．2．3 酶水解產(chǎn)物的HPLC—MS分析：將1．3．2處理過(guò)的樣品經(jīng)0．45μm孔徑的濾膜濾過(guò)待用。HPLC色譜條件：流動(dòng)相A和B；洗脫梯度B相從0％—60％ ，25min；保護(hù)柱和色譜柱；柱溫40℃ ；流速0．25ml／min；上樣量1Oμl ；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210nm。質(zhì)譜條件：干燥氣流速，12 l／min；輔助霧化氣壓力，40Pa；干燥氣溫度，350℃；電噴霧電壓，4 000V；m／z掃描范圍5O～3 000；裂解電壓，120V；質(zhì)譜掃描間隔0．20Da；掃描周期0．97s。

2 結(jié)果

2．1 rLTB的SDS—PAGE電泳和原位酶解：rLTB以包涵體的形式表達(dá)，通過(guò)包涵體溶解和二步純化工藝處理，SDS—PAGE電泳分析rLTB純化產(chǎn)品的純度，見(jiàn)圖1。rLTB的分子量為14 100，圖1箭頭所指的條帶為rLTB，其純度約86％。從圖中可見(jiàn)rLTB純化產(chǎn)品約有6～7條雜蛋白帶。用小刀切下箭頭所指的rLTB條帶，按1．2．2方法進(jìn)行原位酶解。

2．2 rLTB原位酶解結(jié)果分析：經(jīng)TPCK處理的胰蛋白酶專一性酶切位點(diǎn)在肽鏈中K（LyS）和R（nrg）
的羧基端，水解后蛋白產(chǎn)生長(zhǎng)短不等的肽段。rLTB理論氨基酸全序列見(jiàn)圖2，共有124個(gè)氨基酸，含有16個(gè)精氨酸和賴氨酸，胰蛋白酶水解后理論上可以產(chǎn)生17個(gè)肽段或氨基酸。圖2中T1-17為17個(gè)肽段的編號(hào)及所在位置，標(biāo)在每個(gè)肽段的羧基端。

2．3 酶水解產(chǎn)物的HPI_E—MS分析結(jié)果：在分離多肽混合物時(shí)，一般在流動(dòng)相中加入TFA（A相0．1％ ，B相0．085％），可以獲得較好的色譜分離效果。但在液質(zhì)聯(lián)機(jī)中TFA會(huì)抑制多肽的ESI質(zhì)譜信號(hào)，見(jiàn)圖3。圖3A、3B分別為流動(dòng)相中添加TFA的色譜肽圖和質(zhì)譜肽圖，圖3A液相肽圖中可見(jiàn)胰蛋白酶水解的肽段得到較好的分離，而圖3B質(zhì)譜肽圖的樣品信號(hào)幾乎*被抑制了。圖3C、3D為用乙酸（A相0．1％，B相0．1％）代替TFA添加到流動(dòng)相中的液相肽圖和質(zhì)譜肽圖。圖3c液相肽圖中峰的數(shù)目和保留時(shí)間與圖3A液相肽圖中基本一致，同時(shí)獲得很好的質(zhì)譜肽圖見(jiàn)圖3D。

2．4 rLTB質(zhì)譜肽指紋圖的鑒定分析：從圖3D中提取各肽段質(zhì)量數(shù)，進(jìn)行肽段歸屬鑒定分析。表1列出rLTB胰蛋白酶水解所得肽段的實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)和理論質(zhì)量數(shù)，以及二者之間的誤差。

3 討論
    HPLC -MS聯(lián)機(jī)技術(shù)結(jié)合酶解可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸全序列，但對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)的純度要求較高（一般要求達(dá)到98％以上）。rLTB包涵體溶解后，經(jīng)過(guò)二步純化，其純度雖然達(dá)到85％ 以上，仍不能滿足液質(zhì)聯(lián)機(jī)氨基酸序列分析的要求?？紤]到雜蛋白較少，見(jiàn)圖1，SDS—PAGE一維電泳對(duì)其分離即可達(dá)到目的。我們采用SDS—PAGE上的原位酶解方法，即在凝膠中將rLTB水解成多個(gè)肽段，分子量較小的肽段容易離開(kāi)聚丙烯酰胺的膠孔到溶液中。該方法蛋白質(zhì)的水解充分，所得肽段的濃度較高，通過(guò)HPI_E—MS制備出較好的肽指紋圖。
    蛋白質(zhì)或多肽的色譜分離常在流動(dòng)相中加入TFA，改善了色譜的分離效果，卻抑制質(zhì)譜信號(hào)，這對(duì)矛盾的存在，使HPLC—MS在蛋白質(zhì)分析方面并不是一個(gè)的組合，有報(bào)道在液相檢測(cè)器和電噴霧離子化室之間用“TFA—rEX”的柱后修飾可以極大地提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度。但是“TFA—fix”修飾需要一臺(tái)高精度的溶劑添加泵，增加了檢測(cè)程序和檢測(cè)成本。為此本文改變液相流動(dòng)相的條件，選擇不具有強(qiáng)離子對(duì)效應(yīng)的有機(jī)酸代替TFA，可以同時(shí)獲得良好的色譜和質(zhì)譜指紋圖。通過(guò)比較不同比例的甲酸和乙酸，zui后篩選出在A、B流動(dòng)相中分別加入0．I％的乙酸，達(dá)到較好的HPLC—MS檢測(cè)效果。該方法簡(jiǎn)化了HPLC—MS檢測(cè)步驟，彌補(bǔ)HPLC—MS在蛋白質(zhì)分析方面的局限，可以同時(shí)獲得較好的色譜和質(zhì)譜肽指紋圖，并通過(guò)質(zhì)量數(shù)鑒定分析獲得目的蛋白的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

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