2025年1月23日，神戶學(xué)院大學(xué)的Ken-ichi Mizutani研究團(tuán)隊(duì)在期刊《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》上發(fā)表了一篇題為“Rosae multiflorae fructus extracts regulate the differentiation and vascular endothelial cell-mediated proliferation of keratinocytes"的論文。研究聚焦野薔薇果提取物對角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)控作用，深入探究其對表皮分化、屏障功能、血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖及傷口愈合的影響，同時(shí)鑒定了發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分及相關(guān)分子機(jī)制。
摘要
角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要組成成分，維持其增殖與分化的精確平衡對于保護(hù)表皮結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。野薔薇果提取物在化妝品行業(yè)應(yīng)用廣泛，但其一角質(zhì)形成細(xì)胞有益作用的分子機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，RMFE可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和三維表皮模型的表皮分化，增強(qiáng)其屏障功能。此外，RMFE能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，而經(jīng)RMFE處理的HUVEC條件培養(yǎng)基可進(jìn)一步促進(jìn)NHEK增殖并提升其傷口愈合能力。成分活性分析表明，槲皮素衍生物可能是介導(dǎo)NHEK和HUVEC對RMFE產(chǎn)生應(yīng)答的關(guān)鍵物質(zhì)。綜上，這些結(jié)果提示RMFE通過直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的間接作用，共同增強(qiáng)表皮功能。
實(shí)驗(yàn)材料與儀器
材料
1. 野薔薇果提取物、化學(xué)化合物（異槲皮苷IQ、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷Q3GA、槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷Q3Gal、鞣花酸EA、鞣花酸4-O-β-D-木糖苷EADX、鞣花酸4-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷EALA、仙鶴草素AM等）、鈣離子檢測試劑盒、細(xì)胞增殖檢測試劑盒、細(xì)胞毒性檢測試劑、凋亡與死細(xì)胞檢測試劑盒、BrdU、Mitomycin C。
2. 細(xì)胞系：人正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人正常真皮成纖維細(xì)胞
3. 培養(yǎng)基及添加物：KGM-Gold培養(yǎng)基及添加因子試劑盒、EGM-2培養(yǎng)基及添加因子試劑盒、FGM-2培養(yǎng)基及添加因子試劑盒。
4. 細(xì)胞模型：三維皮膚表皮培養(yǎng)模型
5. 抗體：抗TJP1一抗、抗LOR一抗、抗OCLN一抗、抗CLDN1一抗、Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG二抗、Alexa Fluor 594標(biāo)記驢抗小鼠IgG二抗、抗BrdU單克隆抗體。
6. 其他：Matrigel、硅膠柱、DAPI染色液。
儀器
CO?培養(yǎng)箱、離心機(jī)、濾膜、酶標(biāo)儀、細(xì)胞分析儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、共聚焦顯微鏡、跨上皮電阻儀、ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀、相差顯微鏡、全功能熒光顯微鏡、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、熱板、ImageJ圖像分析軟件、Adobe Photoshop圖像處理軟件、Microsoft Excel。
ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀
實(shí)驗(yàn)過程
1. 試劑制備與細(xì)胞培養(yǎng)：RMFE凍干粉溶解于實(shí)驗(yàn)緩沖液或培養(yǎng)基中，使用多個(gè)批號提取物驗(yàn)證效果一致性；NHEK、HUVEC、NHDF分別在對應(yīng)培養(yǎng)基中于37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基每2天更換一次，NHEK采用3名供體混合樣本以避免個(gè)體差異。
2. 條件培養(yǎng)基制備：P4代HUVEC或NHDF培養(yǎng)至50%-60%匯合度，經(jīng)RMFE處理24小時(shí)后更換為KGM-Gold培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)基，離心去除細(xì)胞碎片并過濾，制備內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基或成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基，以無細(xì)胞培養(yǎng)的KGM-Gold培養(yǎng)基為對照。
3. 三維皮膚表皮模型培養(yǎng)：將RMFE應(yīng)用于LabCyte EPI-MODEL24 6D模型的角質(zhì)層側(cè)，在37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)2或7天，每日更換含或不含RMFE的培養(yǎng)基。
4. 細(xì)胞增殖檢測：細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24小時(shí)后，經(jīng)RMFE或目標(biāo)化合物處理24小時(shí)，采用Cell Counting Kit-8檢測，測定450 nm處吸光度值并計(jì)算平均吸光度。
5. 細(xì)胞毒性與死細(xì)胞檢測：NHEK接種后經(jīng)不同濃度RMFE處理，采用WST-1試劑檢測細(xì)胞毒性，通過Muse Annexin V & Dead Cell Kit結(jié)合Guava Muse Cell Analyzer檢測凋亡及死細(xì)胞比例。
6. RT-qPCR檢測：提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，采用SYBR Green標(biāo)記進(jìn)行定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因，分析分化標(biāo)志物、屏障功能相關(guān)基因、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物及血管生成相關(guān)基因的表達(dá)水平。
7. 免疫熒光染色與成像：細(xì)胞或三維模型經(jīng)4%多聚甲醛固定、封閉液處理后，加入一抗孵育過夜，再與熒光二抗孵育，DAPI染色細(xì)胞核，通過共聚焦顯微鏡獲取圖像；采用BrdU摻入法結(jié)合免疫熒光染色評估細(xì)胞增殖。
8. 屏障功能檢測：三維模型經(jīng)RMFE處理2天后，使用跨上皮電阻儀檢測TEER值，計(jì)算單位面積電阻；通過ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀檢測TEWL值，模型先在37℃熱板上放置30分鐘后再進(jìn)行測量。
對照組和0.25 μ RMFE 處理的三維培養(yǎng)人表皮模型的跨表皮水分流失(TEWL)值
9. 管形成實(shí)驗(yàn)：48孔板包被Matrigel并孵育，接種P4代HUVEC并加入含RMFE的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6小時(shí)后通過相差顯微鏡獲取圖像，ImageJ軟件分析管長、分支點(diǎn)數(shù)量及連接點(diǎn)數(shù)量。
10. 劃痕實(shí)驗(yàn)：NHEK接種形成單層細(xì)胞后，用微量移液器吸頭劃痕，更換為含RMFE、對照ECCM或RMFE-ECCM的培養(yǎng)基，部分組添加Mitomycin C抑制增殖，培養(yǎng)48小時(shí)并進(jìn)行時(shí)間序列成像，計(jì)算傷口閉合率。
11. LC-TOF/MS分析：采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析RMFE成分，鑒定其含有的化學(xué)化合物。
12. 統(tǒng)計(jì)分析：兩組數(shù)據(jù)采用非配對雙側(cè)Student's t檢驗(yàn)分析差異，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，P<0.05、P<0.01、P<0.001分別表示不同水平。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
1. RMFE可直接促進(jìn)NHEK和三維表皮模型的表皮分化，上調(diào)早期分化標(biāo)志物（K10、SPRR1B）和晚期分化標(biāo)志物（兜甲蛋白、LOR）的表達(dá)，且K10表達(dá)呈劑量依賴性增加；同時(shí)上調(diào)緊密連接相關(guān)基因（OCLN、CLDN1、TJP1）及蛋白表達(dá)，增強(qiáng)TEER值并降低TEWL值，提升表皮屏障功能，該作用并非由鈣離子介導(dǎo)。
2. RMFE能促進(jìn)HUVEC增殖和血管生成，RMFE-ECCM可促進(jìn)NHEK增殖、上調(diào)表皮干細(xì)胞標(biāo)志物（K15、DLL1）表達(dá)，且提升NHEK傷口愈合能力，該愈合作用依賴細(xì)胞增殖而非遷移；而RMFE-DFCM對NHEK無明顯影響，表明RMFE的作用更依賴內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)。
3. LC-TOF/MS鑒定顯示，本研究使用的RMFE為II型（不含多花苷A），包含槲皮素衍生物（IQ、Q3GA、Q3Gal）、鞣花酸及其衍生物（EADX、EALA、AM、EA）等成分。
4. 槲皮素衍生物（尤其是IQ）是RMFE發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分，可直接促進(jìn)NHEK分化和屏障功能形成，降低TEWL值，同時(shí)促進(jìn)HUVEC增殖并上調(diào)血管生成相關(guān)基因（內(nèi)皮粘蛋白、DLL4、Apelin）表達(dá)。
5. 綜上，RMFE通過直接作用于角質(zhì)形成細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的間接作用，雙重調(diào)控表皮增殖與分化平衡，增強(qiáng)表皮屏障功能并促進(jìn)傷口愈合，為其在化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了分子機(jī)制支持。
